Procedía de una familia de clase obrera.Su madre, Emma Nitz, la dio a luz con solo quince años; su padre, Florentino Villaflor, tenía 21, y trabajaba en una fábrica de lana. A los dieciséis años empezó a trabajar como telefonista en una empresa de electrodomésticos. Allí conoció a Pedro De Vincenti, delegado sindical, con quien se casó en 1949 y con quien tuvo cuatro hijos.

El 30 de noviembre de 1976, ocho meses después del comienzo de la dictadura militar que se autodenominó «Proceso de Reorganización Nacional», fueron secuestrados uno de los hijos de Azucena Villaflor, Néstor De Vincenti (quien formó parte desde 1971 del grupo guerrillero Fuerzas Armadas Revolucionariasy para la época de su secuestro integraba la Columna Sur de Montoneros) y la novia de este, Raquel Mangin. Villaflor inició su búsqueda, dirigiéndose al Ministerio de Interior, e intentando recabar la ayuda del vicario militar Adolfo Tortolo (aunque solo consiguió hablar con su secretario, Emilio Grasselli). Durante estas gestiones, conoció a otras mujeres que estaban buscando también a parientes desaparecidos.

Tras seis meses de infructuosas pesquisas, Villaflor, junto a otras personas en su misma situación —que se fueron conociendo en la búsqueda de sus familiares— decidieron iniciar una serie de manifestaciones para dar publicidad a su caso. El 30 de abril de 1977 ella y otras trece madres se manifestaron en la Plaza de Mayo, en el centro de Buenos Aires, enfrente de la sede del gobierno, la Casa Rosada. Ante la orden militar de no detenerse ni «agruparse», sino «circular», decidieron caminar alrededor de la plaza.La primera marcha tuvo lugar un sábado, y apenas tuvo repercusión; la segunda fue un jueves y desde entonces se convirtió en costumbre realizarla todos los jueves, en torno a las tres y media de la tarde.

El 8 de diciembre Alfredo Astiz había dado la señal denunciando la reunión en la iglesia de la Santa Cruz, en la cual secuestraron cinco personas además de Teresa Careaga y María Ponce, ambas madres de desaparecidos y la monja francesa Alice Domon. Azucena Villafor estaba en la casa de Emilio Mignone trabajando con la esposa de este y otras madres, muy asustadas por lo sucedido, para terminar un remitido con los nombres de sus hijos desaparecidos. El día 9 de diciembre, Azucena y otras madres entregaron los originales del remitido, el dinero y las firmas que avalaban su publicación.

Al día siguiente, el 10 de diciembre, Día Internacional de los Derechos Humanos, les publicaron el anuncio en un periódico y esa misma noche Azucena Villaflor fue secuestrada por un grupo armado clandestino de la Armada en la esquina de su casa de Sarandí, en Avellaneda, Buenos Aires. La golpearon para introducirla en un auto pero ella se tiró al suelo y gritó. Entonces la golpearon más. Según testimonios, fue recluida en el campo de concentración de la Escuela de Mecánica de la Armada, ESMA, donde actuó, entre otros represores, Alfredo Astiz. La llevaron al altillo, el lugar en donde depositaban a los secuestrados que mantenían más en secreto. Esa misma noche fue torturada y regresó al calabozo sin conocimiento. A los pocos días, Azucena junto a las monjas francesas y los demás secuestrados en la iglesia de la Santa Cruz fueron "trasladadas" al aeropuerto militar que se encuentra en el extremo sur del Aeroparque de la ciudad de Buenos Aires, subidos sedados a un avión de la Marina y arrojadas vivas al mar frente a la costa de Santa Teresita, muriendo al chocar contra el agua.